De initiatiefnemers van het project Duurzaamheidsroute A35 zijn Rijkswaterstaat, Rijksvastgoedbedrijf, Rijksdienst voor Ondernemend Nederland, de gemeenten Almelo, Borne, Enschede, Hellendoorn, Hengelo, Wierden, provincie Overijssel en waterschap Vechtstromen.
Daarnaast zijn grondeigenaren, direct omwonenden, naastliggende bedrijven, weggebruikers van de A35, A1 en N35, dorpsraden, wijkraden, buurtkringen, ondernemersverenigingen en gemeenteraden belangrijke deelnemers in dit piloproject.